第 1 节：Linux 与参考基因组

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一、章节导入

生物信息学分析通常从“数据文件”开始。对于基因组学研究来说，最基础、最常用的两类文件是：

1. 参考基因组序列文件，通常是 FASTA 格式；
2. 基因结构注释文件，通常是 GFF3 或 GTF 格式。

例如我们研究大豆基因时，首先需要知道：

• 大豆参考基因组有哪些染色体？
• 每条染色体的序列是什么？
• 基因位于哪条染色体上？
• 基因的起始位置和终止位置在哪里？
• 一个基因由哪些外显子、CDS、UTR 等结构组成？
• 大豆基因组中一共有多少个基因？

这些问题都可以通过 Linux 基础命令对 FASTA 和 GFF 文件进行查看、提取和统计来完成。

本节课将以大豆参考基因组为例，学习如何从 Phytozome 下载基因组 FASTA 文件和 GFF 注释文件，并使用 Linux 命令进行初步分析。

课堂提醒：Phytozome、SoyBase、Ensembl Plants、NCBI 等数据库中，同一物种可能存在多个参考基因组版本。下载数据时，应确保 FASTA 文件和 GFF 文件来自同一个物种、同一个品种、同一个版本。

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二、本章学习目标

完成本章学习后，学生应能够：

1. 理解 Linux 命令行在生物信息学中的基本作用；
2. 掌握常用 Linux 基础命令，如 pwd、ls、cd、mkdir、cp、mv、rm、cat、less、head、tail、grep、wc、awk；
3. 了解参考基因组数据库中常见文件类型；
4. 理解 FASTA 文件和 GFF3 文件的基本结构；
5. 能够查看大豆参考基因组文件；
6. 能够从 GFF 文件中提取特定基因信息；
7. 能够使用 awk 统计基因、mRNA、exon、CDS 等数量；
8. 初步理解“基因由哪些组成部分构成”。

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三、Linux 基础命令介绍

3.1 目录和文件操作命令

命令	作用	示例
pwd	显示当前所在目录	pwd
ls	查看当前目录下的文件	ls
ls -lh	以易读方式显示文件大小	ls -lh
cd	进入某个目录	cd genome
cd ..	返回上一级目录	cd ..
mkdir	新建目录	mkdir soybean_genome
mkdir -p	递归创建目录，如果上级目录不存在也会自动创建	mkdir -p ~/bioinfo_course/01_linux_genome
cp	复制文件	cp file1 file2
mv	移动或重命名文件	mv old.txt new.txt
rm	删除文件	rm test.txt
rm -r	删除目录及其内容	rm -r test_dir

示例：

pwd
mkdir soybean_genome
cd soybean_genome
pwd

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3.2 查看文件内容的命令

命令	作用	示例
cat	一次性显示整个文件内容	cat test.txt
less	分页查看大文件	less genome.fa
head	查看文件前几行	head file.txt
tail	查看文件后几行	tail file.txt
head -n 20	查看前 20 行	head -n 20 file.txt
tail -n 20	查看后 20 行	tail -n 20 file.txt

对于基因组文件，通常不建议直接用 cat 查看，因为文件很大，容易刷屏。推荐使用：

less 文件名
head 文件名
tail 文件名

如果文件是压缩文件，例如 .gz 格式，可以使用：

zcat 文件名.gz | head
zcat 文件名.gz | less

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3.3 搜索和统计命令

命令	作用	示例
grep	按关键词搜索	grep "gene" annotation.gff3
grep -v	排除某些行	grep -v "^#" annotation.gff3
wc -l	统计行数	wc -l file.txt
cut	按列提取	cut -f 1 file.txt
sort	排序	sort file.txt
uniq	去重复	uniq file.txt
awk	按列处理和统计	awk '$3=="gene"' annotation.gff3

awk 是生物信息学中非常重要的文本处理工具，尤其适合处理以制表符分隔的文件，例如 GFF、BED、VCF 等。

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四、基因组数据库中常见文件类型

在 Phytozome、Ensembl Plants、NCBI、SoyBase 等数据库中，一个物种的基因组页面通常会包含多种文件。

4.1 Genome FASTA 文件

常见后缀：

.fa
.fasta
.fa.gz
.fasta.gz

作用：

FASTA 文件保存的是参考基因组的 DNA 序列。例如大豆有 20 条染色体，FASTA 文件中通常包含 20 条主要染色体序列，以及一些未定位的 scaffold 或 contig。

FASTA 文件格式示例：

>Gm01
ATGCTAGCTAGCTACGATCGATCG...
>Gm02
ATCGATCGATCGTACGTAGCTAGC...

特点：

• 以 > 开头的行是序列名称；
• 后面的多行是 DNA 序列；
• DNA 序列通常由 A、T、C、G、N 组成；
• N 表示未知碱基。

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4.2 GFF3 注释文件

常见后缀：

.gff
.gff3
.gff3.gz

作用：

GFF3 文件记录基因在基因组上的位置和结构信息，例如：

• gene；
• mRNA；
• exon；
• CDS；
• five_prime_UTR；
• three_prime_UTR。

GFF3 文件一般有 9 列：

列号	名称	含义
第 1 列	seqid	染色体或序列名称
第 2 列	source	注释来源
第 3 列	type	注释类型，如 gene、mRNA、exon、CDS
第 4 列	start	起始位置
第 5 列	end	终止位置
第 6 列	score	得分，若无则为 .
第 7 列	strand	正负链，+ 或 -
第 8 列	phase	CDS 阅读框信息
第 9 列	attributes	注释属性，如 ID、Parent、Name

示例：

Gm01  phytozome  gene  1000  5000  .  +  .  ID=Glyma.01G000100
Gm01  phytozome  mRNA  1000  5000  .  +  .  ID=Glyma.01G000100.1;Parent=Glyma.01G000100
Gm01  phytozome  exon  1000  1200  .  +  .  Parent=Glyma.01G000100.1
Gm01  phytozome  CDS   1050  1200  .  +  0  Parent=Glyma.01G000100.1

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4.3 CDS FASTA 文件

常见后缀：

.cds.fa
.cds.fasta

作用：

CDS 文件保存基因的编码序列，也就是可以翻译成蛋白质的 DNA 序列。

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4.4 Protein FASTA 文件

常见后缀：

.pep.fa
.protein.fa
.aa.fa

作用：

Protein FASTA 文件保存蛋白质序列。后续做 BLAST、结构域分析、同源基因搜索、系统发育树分析时经常使用。

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4.5 Transcript FASTA 文件

常见后缀：

.transcript.fa
.mrna.fa

作用：

Transcript FASTA 文件保存转录本序列，通常包括 UTR 和 CDS 区域。

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4.6 README 或 metadata 文件

这些文件通常说明：

• 数据来源；
• 版本号；
• 文件命名规则；
• 物种信息；
• 下载日期；
• 使用说明。

课堂中要特别强调：

FASTA 文件和 GFF 文件必须来自同一个基因组版本。

例如不能把 Wm82.a2 的 FASTA 和 Wm82.a4 的 GFF 混合使用，否则基因坐标可能对不上。

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五、基因的基本组成

从基因组注释角度看，一个典型真核基因通常包括：

gene
 └── mRNA / transcript
      ├── 5' UTR
      ├── exon
      ├── CDS
      ├── intron
      ├── exon
      ├── CDS
      └── 3' UTR

5.1 gene

表示一个基因在基因组上的完整区域。

5.2 mRNA / transcript

表示该基因产生的转录本。一个基因可能只有一个转录本，也可能有多个转录本。

5.3 exon

外显子，是成熟 mRNA 中保留下来的片段。

5.4 intron

内含子，是转录后会被剪接去除的片段。

注意：在很多 GFF 文件中，intron 不一定直接写出来，可以根据相邻 exon 的间隔推断。

5.5 CDS

CDS 是 coding sequence 的缩写，表示编码区，是最终可以翻译成蛋白质的序列部分。

5.6 UTR

UTR 是 untranslated region 的缩写，表示非翻译区，包括：

• 5’ UTR；
• 3’ UTR。

UTR 不翻译成蛋白质，但可能影响 mRNA 稳定性、翻译效率和调控。

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六、课堂操作练习

练习 1：建立工作目录

任务

在自己的 Linux 环境中建立一个本章练习目录。

命令

mkdir -p ~/bioinfo_course/01_linux_genome
cd ~/bioinfo_course/01_linux_genome
pwd

思考题

1. mkdir -p 中的 -p 有什么作用？
2. pwd 输出的是什么？
3. ~ 代表什么目录？

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练习 2：从 Phytozome 下载大豆参考基因组文件

任务

进入 Phytozome 网站，下载大豆参考基因组的 FASTA 文件和 GFF3 注释文件。

Phytozome 网站：

https://phytozome-next.jgi.doe.gov/

操作步骤

1. 打开 Phytozome 网站；
2. 在搜索框中搜索：

Glycine max

或：

soybean

3. 选择大豆 Williams 82 参考基因组版本；
4. 课堂建议统一选择同一个版本，例如：

Glycine max Wm82.a4.v1

5. 下载以下两类文件：

Genome FASTA 文件
Annotation GFF3 文件

下载后文件名可能类似：

Gmax_508_v4.0.fa.gz
Gmax_508_Wm82.a4.v1.gene.gff3.gz

实际文件名以网站下载页面为准。

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练习 3：查看下载后的文件

任务

查看当前目录下有哪些文件，并观察文件大小。

命令

ls
ls -lh

问题

1. FASTA 文件的后缀是什么？
2. GFF 文件的后缀是什么？
3. 哪个文件更大？
4. 为什么基因组 FASTA 文件通常比较大？

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练习 4：查看 FASTA 文件前几行

假设下载的基因组文件名为：

Gmax_genome.fa.gz

如果你的文件名不同，请替换成自己的文件名。

命令

zcat Gmax_genome.fa.gz | head

如果文件未压缩：

head Gmax_genome.fa

观察内容

你应该能看到类似结构：

>Gm01
NNNNNNNNNNNNNNNNNNNN
ATGCTAGCTAGCTAGCTAGC

问题

1. FASTA 文件中，哪一类行表示序列名称？
2. DNA 序列由哪些字母组成？
3. N 代表什么？

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练习 5：统计 FASTA 文件中有多少条序列

命令

zgrep "^>" Gmax_genome.fa.gz | head

统计序列数量：

zgrep "^>" Gmax_genome.fa.gz | wc -l

解释

在 FASTA 文件中，每一条序列都以 > 开头。因此统计 > 的数量，就可以知道 FASTA 文件中有多少条序列。

思考题

1. 如果结果是 20，说明什么？
2. 如果结果大于 20，可能说明什么？
3. 染色体、scaffold、contig 有什么区别？

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练习 6：提取 FASTA 文件中的序列名称

命令

zgrep "^>" Gmax_genome.fa.gz | head -n 20

只保留序列名称的第一部分：

zgrep "^>" Gmax_genome.fa.gz | sed 's/>//' | awk '{print $1}' | head -n 20

问题

1. 大豆主要染色体是否是 20 条？
2. 序列名称是 Gm01、Chr01，还是其他格式？
3. 为什么后续分析中要注意染色体命名格式？

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练习 7：查看 GFF3 文件前几行

假设注释文件名为：

Gmax_annotation.gff3.gz

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | head

跳过以 # 开头的注释行：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep -v "^#" | head

问题

1. GFF3 文件有几列？
2. 每列之间用什么分隔？
3. 第 3 列表示什么？
4. 第 4 列和第 5 列表示什么？

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练习 8：查看 GFF 文件中有哪些注释类型

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep -v "^#" | cut -f 3 | sort | uniq

统计每种类型的数量：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep -v "^#" | cut -f 3 | sort | uniq -c

可能看到的类型

gene
mRNA
exon
CDS
five_prime_UTR
three_prime_UTR

问题

1. gene 和 mRNA 是同一个概念吗？
2. exon 和 CDS 有什么区别？
3. 为什么一个基因可能对应多个 mRNA？

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练习 9：统计大豆基因数量

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene"' | wc -l

更严谨地跳过注释行：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$0 !~ /^#/ && $3=="gene"' | wc -l

解释

在 GFF3 文件中，第 3 列表示 feature 类型。当第 3 列等于 gene 时，该行代表一个基因。

问题

1. 大豆基因组中一共有多少个 gene？
2. 这个数量是否等于 mRNA 数量？
3. 如果 mRNA 数量多于 gene 数量，说明什么？

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练习 10：分别统计 gene、mRNA、exon、CDS 数量

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$0 !~ /^#/ {print $3}' | sort | uniq -c

只统计指定类型：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene"' | wc -l
zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="mRNA"' | wc -l
zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="exon"' | wc -l
zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="CDS"' | wc -l

练习记录表

类型	数量
gene
mRNA
exon
CDS

思考题

1. 为什么 exon 数量远大于 gene 数量？
2. 为什么 CDS 数量可能和 exon 数量不完全相同？
3. UTR 是否属于 CDS？

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练习 11：提取前 10 个基因的信息

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene"' | head

提取前 10 个基因的染色体、起始位置、终止位置和属性信息：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene" {print $1,$4,$5,$7,$9}' | head -n 10

如果想让输出以制表符分隔：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk 'BEGIN{OFS="\t"} $3=="gene" {print $1,$4,$5,$7,$9}' | head -n 10

问题

1. 第 1 列是什么？
2. 第 4、5 列是什么？
3. 第 7 列的 + 和 - 代表什么？
4. 第 9 列中是否包含基因 ID？

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练习 12：自动提取第一个基因 ID

不同版本的 GFF 文件中，基因 ID 格式可能略有差异。可以先自动提取第一个 gene 的 ID。

命令

GENE_ID=$(zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene"{print $9; exit}' | sed -E 's/.*ID=([^;]+).*/\1/')

echo $GENE_ID

解释

这条命令完成了三件事：

1. 找到第一个 gene 行；
2. 提取第 9 列属性信息；
3. 从 ID=xxx 中提取基因 ID。

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练习 13：提取某一个特定基因的全部注释信息

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep "$GENE_ID"

如果你已经知道某个基因 ID，例如：

Glyma.01G000100

可以使用：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep "Glyma.01G000100"

观察内容

你可能会看到：

gene
mRNA
exon
CDS
UTR

等多种注释行。

问题

1. 这个基因位于哪条染色体？
2. 起始位置是多少？
3. 终止位置是多少？
4. 位于正链还是负链？
5. 这个基因有几个 exon？
6. 这个基因有几个 CDS？

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练习 14：统计某个基因有多少个 exon 和 CDS

以 $GENE_ID 为例：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep "$GENE_ID" | awk '$3=="exon"' | wc -l

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | grep "$GENE_ID" | awk '$3=="CDS"' | wc -l

问题

1. exon 数量是多少？
2. CDS 数量是多少？
3. exon 数量和 CDS 数量是否相同？
4. 如果不同，可能是什么原因？

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练习 15：计算每个基因的长度

基因长度可以用：

end - start + 1

计算。

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk 'BEGIN{OFS="\t"} $3=="gene" {print $1,$4,$5,$5-$4+1,$9}' | head

输出列含义：

染色体    起始位置    终止位置    基因长度    属性信息

问题

1. 为什么要加 1？
2. 基因长度是否等于 CDS 长度？
3. 一个基因很长，是否一定编码很长的蛋白？

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练习 16：统计每条染色体上的基因数量

命令

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene"{print $1}' | sort | uniq -c

整理成更清楚的格式：

zcat Gmax_annotation.gff3.gz | awk 'BEGIN{OFS="\t"} $3=="gene"{count[$1]++} END{for(chr in count) print chr,count[chr]}' | sort -k1,1

记录表

染色体	基因数量
Gm01
Gm02
Gm03
…

思考题

1. 每条染色体上的基因数量是否相同？
2. 基因数量多的染色体一定更长吗？
3. 染色体长度和基因数量之间可能有什么关系？

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七、综合练习

综合任务 1：完成大豆参考基因组文件初步检查

请完成以下任务，并将命令和结果记录下来。

任务要求

1. 创建工作目录；
2. 下载大豆参考基因组 FASTA 和 GFF3 文件；
3. 查看两个文件的大小；
4. 查看 FASTA 文件前 10 行；
5. 统计 FASTA 文件中有多少条序列；
6. 查看 GFF3 文件前 10 行非注释内容；
7. 统计 GFF3 中 gene、mRNA、exon、CDS 的数量；
8. 提取一个基因的完整注释信息；
9. 统计每条染色体上的基因数量。

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综合任务 2：整理结果表格

请学生整理如下表格：

项目	结果
使用的物种	Glycine max
使用的品种/参考基因组	Williams 82
使用的版本	例如 Wm82.a4.v1
FASTA 文件名
GFF3 文件名
FASTA 中序列数量
gene 数量
mRNA 数量
exon 数量
CDS 数量
示例基因 ID
示例基因所在染色体
示例基因起始位置
示例基因终止位置
示例基因正负链
示例基因 exon 数量
示例基因 CDS 数量

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八、课后思考题

8.1 概念题

1. 什么是参考基因组？
2. FASTA 文件主要保存什么信息？
3. GFF3 文件主要保存什么信息？
4. gene、mRNA、exon、CDS、UTR 分别是什么意思？
5. 为什么基因组 FASTA 和 GFF 文件必须来自同一个版本？

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8.2 命令题

解释以下命令的含义：

zgrep "^>" genome.fa.gz | wc -l

zcat annotation.gff3.gz | awk '$3=="gene"' | wc -l

zcat annotation.gff3.gz | grep -v "^#" | cut -f 3 | sort | uniq -c

zcat annotation.gff3.gz | awk 'BEGIN{OFS="\t"} $3=="gene"{print $1,$4,$5,$5-$4+1,$9}' | head

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8.3 拓展题

1. 如果一个基因有多个 mRNA，说明什么？
2. 为什么 exon 数量通常远多于 gene 数量？
3. 为什么 CDS 不等于 exon？
4. 为什么有些基因在负链上？
5. 如果一个基因位于负链，它的 start 和 end 是否会反过来写？

十、参考网址

• Phytozome: https://phytozome-next.jgi.doe.gov/
• SoyBase: https://www.soybase.org/
• NCBI Genome: https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genome/
• Ensembl Plants: https://plants.ensembl.org/